原标题：基于网络药理学和分子对接技术清咳平喘颗粒治疗新冠病毒肺炎（COVID-19）分子机制研究

  从2019年开始，由新冠病毒（SARS-CoV-2）所引起的急性呼吸道传染病新冠病毒肺炎（COVID-19）在全球范围内广泛流行，已严重危及到全人类的生命健康问题，此公共卫生事件引起了全球的高度关注［1］。根据国家卫生健康委员会及中医药管理局最新发布的《新冠病毒肺炎诊疗方案（试行第10版）》，SARS-CoV-2在人群传播过程中基因的不稳定性易使其发生突变，现传播速度快、逃脱能力强的奥密克戎（Omicron）变异株逐步成为非常大的优势流行株，但致病力明显减弱［2］。咳嗽是COVID-19在感染急性期的主要表现症状，并且持续存在于感染后阶段。咳嗽不仅给患者带来痛苦，还增加了通过呼吸道传播的风险［3］。尤其是在COVID-19大流行期间，咳嗽患者可能会受到污名化，甚至导致社会孤立［4］。寻求控制COVID-19相关咳嗽的治疗方法有助于防止疾病传播，并消除其带来的社会压力。

  COVID-19中医辨证属“瘟疫”范畴，其病理核心为“湿毒”，病位在肺，病机特点为“湿、毒、瘀、闭”［5］。在COVID-19大流行期间，中医药在疾病治疗中发挥了巨大的作用［6］。中医药治疗SARS-CoV-2感染有其独特优势，在改善患者症状、减少转重率、改善预后等方面有很明显的成效。清咳平喘颗粒是在经方“麻杏石甘汤”的基础上加上金荞麦、鱼腥草、矮地茶、川贝母、枇杷叶、紫苏子等共由10味中药而形成的中药复方制剂。临床研究显示［6］清咳平喘颗粒用于轻型、普通型新冠病毒感染患者的疗效显著，能显著改善患者日间及夜间咳嗽症状，提高患者感染期间的生活品质。此外该复方先后被纳入《新冠肺炎感染者居家中医药健康管理专家共识》《新冠病毒感染防治“两保一稳”清单》，推荐用于COVID-19成人及儿童咳嗽的治疗。然而，清肺平喘颗粒治疗COVID-19的潜在作用机制尚未明确，仍需进行深入研究。

  网络药理学是以系统生物学理论为基础的一门新兴学科，它通过一系列分析生物系统的网络，选择特定的信号节点来设计多靶点药物分子，可构建药物、成分、靶点、疾病之间的关联性，目前被慢慢的变多地用于中医药研究［7］。分子对接是一种基于受体特性及受体与药物分子之间相互作用的药物设计方法，是一种可以预测中药单体与疾病靶点结合模式、亲和力的理论模拟方法。本研究采用网络药理学方法，探讨清咳平喘颗粒治疗COVID-19的有效活性成分、关键作用靶点及相关信号通路，并将关键中药单体与COVID-19关键靶点进行分子对接验证，旨在阐明清咳平喘颗粒抗COVID-19的作用机制，为其防治COVID-19及后期的深入研究提供理论依据。

  中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：），以清咳平喘颗粒中9味中药（矮地茶、川贝母、金荞麦、苦杏仁、麻黄、枇杷叶、鱼腥草、炙甘草、紫苏子，组方中石膏除外）为检索词，收集清咳平喘颗粒药材组方成分并下载。结合文献及《中国药典》，确定清咳平喘颗粒成分。所有成分需满足以下条件：①成分可在TCMSP中检索；②中国药典（2020年版）中规定的药材的指标成分；③有文献明确记载的活性成分。

  本研究基于药物的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）模型，通过TCMSP数据库获得化学成分的口服生物利用度（OB）和类药性（DL）信息，从“1.1”项建立的清咳平喘颗粒化合物分析库中筛选OB≥30%、DL≥0.18的活性成分及其对应的蛋白靶点［8］。同时将筛选出的清咳平喘颗粒活性成分导入SwissTargetPredicton与PharmMapper数据库搜索药物潜在靶点，合并去重所有的靶点，作为清咳平喘颗粒活性成分的作用靶点。通过UniProt数据库［9］（https：//）中UniProtKB搜索功能检索蛋白靶点ID及基因名，获得清咳平喘颗粒相关靶点信息。

  在CTD数据库（http：）中，Keyword Search选择Disease，以关键词“COVID-19”进行搜索，保留在gene项下Direct Evidence项中有“M”（疾病的生物标志物或在病因中起作用的靶点）和“T”（疾病治疗靶点）标记的靶点。基于GeneCards数据库（https：//），以关键词“COVID-19”进行检索，保留InferenceScore≥0.8的靶点。将2个数据库中检索到的靶点合并去重，得到COVID-19疾病相关靶点。

  1.5靶点的基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

  采用Cytoscape 3.7.2关联化合物、关键靶点以及富集通路，构建“化合物-靶点-通路”网络，并进行拓扑学参数分析。

  为验证核心靶点与清咳平喘颗粒化合物之间作用的可信度，选取“1.6”项建立的化合物-靶点-通路中degree值排名前5的核心靶点、清咳平喘颗粒中degree值排名前5的活性成分进行分子对接验证。从RSCB PDB数据库（https：//）获取排名前5的核心蛋白，下载PDB格式文件，通过Pymol软件对上述蛋白进行去除结晶水和小分子等处理。从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载化合物结构的2D结构文件（SDF格式），采用ChemDraw软件转化成“*mol2”格式。通过AutoDockTools 1.5.6软件处理蛋白靶点与小分子化合物并将其转化为pdbqt格式，运用Vina 1.5.6进行分子对接。同时，对接结果通过Pymol软件进行可视化分析。

  通过TCMSP检索到清咳平喘颗粒中所含化学成分共1 555个，其中矮地茶193个、川贝母63个、金荞麦61个、苦杏仁113个、麻黄363个、枇杷叶304个、鱼腥草50个、炙甘草280个、紫苏子128个。矿物药石膏的主要成分为二水合硫酸钙，未被收录。以OB≥30%且DL≥0.18为阈值，对1 555个成分进行筛选，最终确定清咳平喘颗粒活性成分144个，其中矮地茶13个、川贝母9个、金荞麦12个、苦杏仁17个、麻黄22个、枇杷叶13个、鱼腥草5个、炙甘草73个、紫苏子15个，其中36个成分是共有成分。以上9味药材，每种药材选择有代表性的5个成分，具体信息见表1。

  将筛选出的261个共有靶点借助STRING数据库构建PPI网络，平均degree值等于28.0，将结果导入Cytoscape 3.7.2软件，利用拓扑分析插件CytoNCA限定degree＞28.0，设置节点的大小、颜色、透明度随degree值的变化而变化，构建PPI网络图，见图2。选取Degree值大于平均数的靶点作为核心靶点，共计91个。其中节点颜色越深代表Degree值越大，根据结果得出，TNF、IL6、ALB、AKT1、VEGFA等靶点处于网络核心位置，提示其可能是清咳平喘颗粒治疗COVID-19引起的咳嗽的核心靶点。

  在DAVID数据库中对上述91个关键交集靶点进行GO功能富集分析，其中GO分析包含3个子项，分别为生物学过程（BP）、细胞组分（CC）与分子功能（MF）。上述91个关键靶点共计涉及1 011个BP，199个CC及298个MF。主要的GO二级注释见图3-A，在BP层面，上述关键靶点主要参与免疫应答、细胞激活等；在CC层面，上述关键靶点主要定位于内膜系统、细胞质等；MF分析显示，上述关键靶点主要涉及催化活性、药物结合等。此外，利用DAVID平台对91个关键靶点进行KEGG通路分析富集到152条KEGG通路，排名前15的KEGG通路见图3-B，主要涉及TLR、IL-17、HIF-1等信号通路。上述结果提示，TLR、IL-17和HIF-1信号通路可能是清咳平喘颗粒治疗COVID-19的核心通路。

  选择KEGG分析中排名前15个通路里富集到的靶点，与这些靶点对接的化合物以及15条通路导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“化合物-靶点-通路”网络，见图4，并进行拓扑学参数分析。对应的99个清咳平喘颗粒成分参与网络调控，麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酚、酸藤子醌、甘草宁G为degree值排名前5的化合物，提示麻黄碱、苦杏仁苷等化合物可能是清咳平喘颗粒治疗COVID-19所引起咳嗽的关键化合物。此外，TLR、IL-17、HIF-1等信号通路主要参与清咳平喘颗粒治疗COVID-19的过程。本实验结果体现了中药复方通过“多成分-多靶点-多途径”治疗疾病的特点。

  为了进一步探讨清咳平喘颗粒活性成分与COVID-19靶点的结合模式，将“化合物-靶点-通路”网络中degree值排名前5的成分（麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酚、酸藤子醌、甘草宁G）与排名前5的共有靶点［TNF（PDB ID：7JRA）、IL6（PDB ID：4CNI）、ALB（PDB ID：1GNI）、AKT1（PDB ID：7NH4）、VEGFA（PDB ID：5O4E）］进行对接，选择对接得分排名最高的化合物，与排名前5的共有靶点的分子对接结构可以进行构象叠合分析。如图5所示，5个化合物均能较好地占据蛋白靶点的特异性结合口袋，三维构象上存在高度契合匹配现象。其中麻黄碱结构中的羟基与TNF的氨基酸残基GLY-224等之间形成氢键；苦杏仁苷结构中的羟基与IL6的氨基酸残基LEU-177等之间形成氢键；麻黄碱结构中的羟基与ALB的氨基酸残基LEU-115之间形成氢键；苦杏仁苷结构中的2-苯基色原酮母核与AKT1的氨基酸残基ASP-44等之间形成氢键；麻黄碱结构中的羟基与VEGFA的氨基酸残基ILE-253之间形成氢键。对接得分的详细结合信息见表2。

  COVID-19对社会经济建设和国民生命健康都带来了难以估量的损失［11］，自2019年12月COVID-19暴发以来，全球已有275 233 892人感染，病死率约为2%［12］，尤其是一些老年兼有基础疾病的患者死亡风险大幅度的增加［13-14］，给人民群众带来非常大的经济负担及情感伤害。此外，SARs-CoV-2毒株的高度变异性为特效药的研制带来极大的挑战，目前所推荐的瑞德西韦、巴瑞替尼临床获益依然有限［15］。因此，相较单一的化学药治疗，中医药在治疗COVID-19中发挥了巨大的作用［16-17］，针对突变的病毒采用辨证施治的治疗原则，根据患者个体情况做加减化裁，实现一人一方［18-19］，临床疗效显著。清咳平喘颗粒是在经方“麻杏石甘汤”的基础上化裁而来的中成药制剂，其治疗COVID-19的有效性已得到临床证实，但由于多成分、多靶点的特点，其治疗COVID-19的药效物质基础及作用机制难以被系统揭示。因此，借助网络药理学及分子对接技术探讨研究清咳平喘颗粒抗COVID-19的作用机制，可为该药的临床应用进一步提供证据支撑，对于COVID-19患者的指导用药也具备极其重大意义。

  发热、咳嗽是COVID-19的早期临床表现，而咳嗽在阳性患者转阴后仍会持续较长时间，咳嗽的强烈程度以及持续性严重影响患者的生活品质。“化合物-靶点-通路”网络表明，麻黄碱、苦杏仁苷等中药单体是清咳平喘颗粒中抗COVID-19的主要药效成分。研究表明，麻黄在抗炎、解热、镇痛方面具有非常明显疗效［20］，麻黄碱是麻黄中发挥平喘作用的主要成分，可通过直接松弛平滑肌，发挥拟肾上腺素作用，抑制过敏性介质的释放，从而发挥平喘疗效［21］。同样，苦杏仁中的苦杏仁苷亦具有止嗽平喘之效。研究显示苦杏仁苷在肺组织中呈高表达，且对支气管平滑肌细胞的抑制作用随浓度的增加而增强［22-23］。此外，还有研究发现麻黄和杏仁的配伍比例为2∶1时可最大限度减少炎性因子的分泌，而介导咳嗽的重要诱因是炎症因子，因此以2∶1配伍的麻黄和杏仁具有最好的止咳效果［24］。有必要注意一下的是，清咳平喘颗粒中的石膏为含水硫酸钙（CaSO4·2H2O）的矿石，亦是方剂中的重要成分，且生石膏具有清热泻火、除烦止渴之功。有学者觉得，石膏中钙盐是其退热作用的有效成分。综上，麻黄碱、苦杏仁苷可能是清咳平喘颗粒在新冠病毒感染期间发挥止咳、平喘作用的主要药效成分，而硫酸钙则是清咳平喘颗粒发挥退热作用的主要成分。

  PPI网络分析结果为TNF、IL6、ALB、AKT1和VEGFA是清咳平喘颗粒抗COVID-19的重要靶点之一。研究显示肺组织的损伤所致程度与TNF和IL-6等炎症因子的产生紧密关联［25］。肿瘤坏死因子（TNF）是一种炎症细胞因子，具有广泛的生物学活性，可促进炎症细胞聚集和其他炎性因子释放，参与防御细菌、病毒和寄生虫的感染，提高组织修复功能，以及诱发肿瘤细胞的凋亡等。研究显示哮喘、多发性硬化症、败血性休克、恶质病等疾病的引发都与TNF相关［26-27］。白细胞介素6（IL-6）是一种具有多种效用的细胞因子，在免疫应答中扮演重要角色，可通过膜结合IL6受体和可溶性IL6受体发出信号［28］。IL-6在感染、肿瘤和炎症反应中发挥关键作用，对疾病进程和临床结局产生重要影响［29］。IL-6的释放与TNF-α有关，且TNF-α、IL-6水平与肺炎咳嗽的严重程度呈正相关，是导致炎症反应加剧而引起气道高反应性发生的重要原因［30］。当肺部炎症发生时，TNF-α、IL-6、RAGE水平上升，并在炎症得到缓解时逐渐恢复至正常水平［31］，与此同时，TNF-α、IL-6等炎性细胞因子的产生亦会引发气道的各种炎症反应而导致非常严重的干咳［32］。因此TNF和IL6可能是清咳平喘颗粒在抗新冠病毒感染期间治疗咳嗽的重要靶点之一。

  GO及KEGG通路富集分析表明，清咳平喘颗粒治疗COVID-19的关键通路涉及Toll样受体信号通路、IL-17信号通路及HIF-1信号通路。Toll样受体（TLR）能够识别病毒颗粒并激活先天免疫系统发挥保护机体作用。TLR通路的激活导致促炎细胞因子的分泌，如IL-6、TNFα以及1型干扰素［33］。TLR7/8是X染色体上的串联复制基因，位于核内体膜上，识别ssRNA和合成的低聚核糖核苷酸，可能参与了SARs-CoV-2基因组的识别［34］。TLR7在单核巨噬细胞和DC上表达，其激活导致IL-1、IL-6、单核细胞趋化蛋白1、MIP 1A、TNF α和1型IFN的产生［35］。在COVID-19患者中，TLR7/8的激活可诱导机体强烈的促炎反应，导致急性肺损伤［36］。此外，TLR2/6/9激动剂还可激活先天免疫细胞和肺上皮细胞，产生各种抗感染因子［37］。脂多糖诱导的急性肺损伤患者主要因其IL-17信号通路被活化，激活的IL-17可通过细胞外信号调节酶（ERK1/2）及NF-κB信号通路导致疾病［38］。HIF-1α和促炎细胞因子在患者感染的细胞中被诱导，SARS-CoV-2 ORF3引起线粒体损伤和Mito-ROS的产生，从而促进HIF-1α信号通路的表达，从而促进SARS-CoV-2感染和细胞因子的产生。总的来说，在SARS-CoV-2感染期间，ORF3a诱导HIF-1α，HIF-1α反过来加重病毒感染和炎症反应。因此，HIF-1α在促进SARS-CoV-2感染和诱导COVID-19促炎反应中发挥及其重要的作用［39］，因此，清咳平喘颗粒可通过调控Toll样受体信号通路、IL-17信号通路及HIF-1信号通路来调节机体免疫反应和抑制机体的炎症反应，预防炎症导致的急性肺损伤来抵抗COVID-19。

  分子对接根据结果得出，麻黄碱以及苦杏仁苷对于蛋白靶点TNF、IL6、ALB、AKT1和VEGFA具备比较好的结合作用，可能是潜在的活性成分，部分验证了上述网络药理学的筛选结果。但由于疾病的特殊性以及网络药理学的局限性，本研究结果还要进一步实验研究及临床应用来验证。

  本研究利用互联网药理学技术对清咳平喘颗粒抗COVID-19及改善感染期间的临床症状进行作用机制探究，得到清咳平喘颗粒涉及多成分、多靶点、多通路参与治疗COVID-19，从而缓解COVID-19时期高热、咳嗽、气喘、咽痛等症状。其中麻黄碱、苦杏仁苷可能是其发挥止咳、平喘作用的主要成分，并主要是通过作用于TNF、IL6、ALB、AKT1和VEGFA等核心靶点，调控Toll样受体信号通路、IL-17信号通路及HIF-1信号通等发挥免疫调节及抗炎作用。该研究在阐明清咳平喘颗粒治疗COVID-19的作用机制方面具有一定的理论现实依据，可为后期深入实验研究来进一步探讨和挖掘清咳平喘颗粒治疗COVID-19的复杂作用机制奠定基础。

  来 源：孙宝迪，夏斌，俞燕露，史芸轩，邵旦兵．基于网络药理学和分子对接技术清咳平喘颗粒治疗新冠病毒肺炎（COVID-19）分子机制研究[J].药物评价研究, 2023, 46(10): 2016-2025.返回搜狐，查看更加多